【文献阅读】脱细胞猪心包膜的生物相容性及成骨性能的体内外评价

尤鹏越，刘玉华，王新知，王思雯，唐琳

作者单位：1、北京大学口腔医学院口腔医院；2、国家口腔疾病临床医学研究中心口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室；3、口腔数字医学北京市重点实验室

【摘要】

目的：

体外检测作为引导性骨再生术（Guided bone rgeneratior，GBR）屏障膜的脱细胞猪心包膜(Aellular porcine pericardium, APP）的形貌特性及生物相容性。建立动物模型，检测其体内屏障软组织长入骨缺损的作用及对促成骨的影响。

方法：

首先，扫描电镜检测APP膜的超微结构。然后进行体外生物相容性检测，将人骨髓间充质干细胞（Human bone marrow mesenchymal stem cell，hBMSCs）接种于APP膜（博纳膜®）及纯胶原膜（Bio-Gide®，简称BG膜）上，使用细胞计数试剂盒（Cell counting kit-8, CCK-8）检测接种后1、3、7天细胞增殖情况：接种后5天，通过鬼笔环肽+DAPI对细胞骨架及细胞核进行染色，观察hBMSCs在两种膜上的增殖及粘附情况。在体外实验基础上，建立体内3只比格犬、18个实验位点的牙槽嵴保存动物实验模型，随机平均分为: APP 膜组，拔牙窝内植入Bio-Oss®骨粉并覆盖APP膜；BG膜组，拔牙窝内植入Bio-Oss®骨粉并覆盖Bio-Gide®膜，空白组，自然愈合。术后4周及12周进行Micro-CT扫描检测各组成骨情况，脱钙后进行HE染色，组织学观察各组愈合情况。

结果：

电镜下APP膜具有致密及疏松双层非对称及三维多孔超微结构。体外实验证实APP膜可以促进 hBMSCs的增殖及粘附，在接种后第7天APP组细胞数量显著高于BG组(P<0.05)。体内实验拔牙窝整体成骨表明: 4周时，三组新生骨比例差异无显著性(P>0.05)；12周时，APP组、BG组之间新生骨比例差异无显著性(P>0.05)，但均显著高于空白组 (P<0.05)。冠方成骨表明：4周时，APP组及BG组膜下方成骨显著高于空白组(P<0.05), p="""""""""""">0.05)；12周时，APP组及BG组膜下方成骨显著高于空白组(P<0.05)，两组之间差异有显著性(P<0.05)。颊侧骨嵴顶相对吸收量表明: 4周时，APP组显著低于空白组(P<0.05)，bg组低于空白组，差异无显著性(p>0.05)；12周时，各组颊侧骨嵴顶继续降低，APP组相对吸收量仍显著低于空白组(P<0.05), p="""""""""""">0.05)。

【结论】

APP膜具有屏障膜良好的三维结构及细胞相容性。其在GBR中起到良好屏障软组织的效果的同时，能够显著促进膜下方成骨及减少颊侧牙槽嵴顶吸收，推测其具有潜在的骨诱导潜质。

【关键词】

心包膜；可吸收膜；人骨髓间充质干细胞；引导性骨再生术。

引言

各种原因引起的牙齿缺失是口腔领域常见疾病之一。越来越多的患者选择种植治疗作为修复口内缺失牙的首选方式，而手术的可能性及长期预后往往取决于缺牙区域的骨质及骨量[1]。引导性骨再生技术（Guided bone regeneration, GBR）的出现成为牙槽骨再生领域一项重要进展[2]。它通过在骨缺损区域内填充骨替代材料，并覆盖屏障膜将快速生长的上皮细胞及结缔组织细胞隔离开来，使得具有骨再生潜能的细胞如成骨细胞、牙周膜干细胞更好的在缺损区域发挥成骨作用，以实现牙槽骨骨量及骨质的提升[3.4]。

屏障膜的选择是影响GBR的重要因素之一，屏障膜应具备良好的生物相容性、屏障性、一定的机械强度、易操作性等[5]。可吸收的屏障膜因其可降解性、无需二次取出、感染及暴露风险低，广受临床医生青睐[6]。来源广泛的天然胶原类可吸收膜由于其是细胞外基质的重要有机成分，具有凝血、募集牙周膜干细胞及牙龈成纤维细胞等功能，同时具有半透性，能够维持营养物质交换的优势[7]，成为应用最为广泛的屏障膜。但一些研究发现，这类纯胶屏障膜组组织整合过程中，多核巨细胞及多形核白细胞分泌的胶原酶加速胶原体内降解过程，使得再生过程具有不确定性[8]，有研究表明其在体内4周以内几乎院解完全[9,10]。为此，寻找一种降解时间更适宜骨再生进程的胶原膜成为学者们研究的重点。细胞外基质膜(Extracellular matrix, ECM) 应运而生，成为组织再生领域重要的生物材料。主要由猪、牛等动物的小肠黏膜下层、心包膜、真皮等组织通过脱细胞技术加工而成，ECM保留了一定量的纤维、蛋白、多糖等，更具备募集生长因子及组织修复相关细胞的潜力[11,12]。其中脱细胞猪心包膜（Acellular porcine pericardium，APP）在临床外科修复腹壁、疝、心瓣膜、硬脑膜等被证实具有良好的生物性能[13,14]。APP由I型及III型胶原构成外，富含弹性蛋白，使得其具备比纯胶原膜更好的机械强度[13-16]；在与宿主组织作用过程中，炎症反应较轻，同时可实现良好的再细胞化及再血管化[17]，要有学者发现其体内降解速度更加匹配骨修复进程[18]。但以往的文献表明，对其相关性能仍缺乏更多的评价。

本研究旨在评价一种新型脱细胞猪心包膜（博纳膜®，北京博纳格科技有限公司提供，中国）的生物相容性，并探究其在犬拔牙窝实验模型中作为屏障膜应用时对成骨效果的影响。

1、材料与方法

1.1 主要材料与试剂

脱细胞猪心包膜(博纳膜®，北京博纳格科技有限公司提供，中国)、Bio-Gide®可吸收生物膜(Geistich公司，瑞士)、Bio-Oss®去蛋白牛骨基质骨替代材料(Geistlich公司，瑞士)、α-MEM培养基(Hyclone，美国)、胎牛血清 (Gibeo，美国)、青链霉素混悬液(Sigma，美国)、 0.25%胰蛋白酶(Gibco，美国)、CCK-8试剂盒(同仁，日本)、FITC标记鬼笔环肽(索莱宝，中国)、DAPI即用型染液(索莱宝，中国)等。

1.2 主要仪器与设备

场发射扫描电子显微镜(Zeiss，德国)、细胞培养箱(Thermo，美国)、酶标仪(Biotek，美国)、激光共聚焦显微镜(Leica，德国)、Micro-CT(Inveon MM CT,Siemense，美国)、轮式组织切片机(Microm，德国)、光学显微镜(Olympus，日本)等。

1.3 APP 膜微观形貌观察

将APP膜裁剪为0.5cmx0.5cm大小，经金属离子溅射仪对试样进行喷金处理后，场发射扫描电子显微镜观察其微观结构。

1.4 APP膜体外生物相容性检测

1.4.1 骨髓间充质干细胞增殖实验

将APP膜、Bio-Gide®膜裁剪为5mm真径圆形试样，置于96孔板中，使用培养基预孵24h。提取培养人骨髓间充质干细胞(human bone marow mesenchymal stem cells, hBMSCs)，将P4代hBMSCs以5x103个/孔接种于膜上，在培养第1、3、7天，依照CCK-8试剂盒说明书测定细胞增殖情况。每组3个复孔，实验重复3次。

1.4.2 骨髓间充质干细胞增殖形态观察

接种方法向上。在培养至第5天时，4%多聚甲醛固定细胞15min,0.5%Triton-X100透化10min, 5%6BSA封闭1h, 加入1:200稀释的鬼笔环肽工作液，室温避光孵育30min, PBS充分清洗后，加入DAPI染液复染细胞核30s，激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopy, CLSM)观察。

1.5 犬牙槽嵴保存动物实验

1.5.1 实验动物

选取3只雄性比格犬，年龄18-24个月，体重12-14kg(购买自北京市昌扬西山养殖场，饲养于军事科学院)，入住至少7天后开始实验。动物全程饲以软食。本实验已经北京大学生物医学伦理委员会批准，批准号为LA2018293。

1.5.2 实验分组

拔除比格犬一侧上下颌第一前磨牙及第二前磨牙远中根(近中根完善根管治疗)，作为12周组实验位点，选取其中9个位点，平均随机分为以下3组：APP组，拔牙窝内植入Bio-Oss®骨粉并覆盖APP膜，严密缝合；BG组，拔牙窝内植入Bio-Oss®骨粉并覆盖Bio-Gide®膜，严密缝合；空白组，自然愈合。8周后，拔除另一侧上下颌第一前磨牙及第二前磨牙远中根，选取其中9个位点，处理方法同上，作为4周组实验位点。

1.5.3 实验方法

异氟烷吸入麻醉下，1%碘伏消毒动物口周，0.12%氯己定容液消毒口内术区。使用涡轮手机水冷下沿第二前磨牙(P2)中央颊沟分冠达根分叉处，近中根开髓、根管治疗、树脂充填。使用牙龈分离器分离牙龈，微创技除P1及P2的远中根。翻开颊舌(腭)侧牙龈全厚瓣，将APP膜或BG膜修剪至合适大小，将膜一端插入舌(腭)侧牙龈与骨板间，填充无菌生理盐水适当润湿后的骨粉至平齐牙槽嵴顶，将膜另一端盖过拔牙窝插入颊侧牙龈与骨板间，严密缝合，术后8 周，另一侧进行相同手术方法处理。术后3天予动物肌注80方单位青霉素钠，每天进行口腔冲洗，饲软食，定期复查伤口愈合情况。

术后12周，空气栓塞法牺往动物，截取上下领骨P1、P2处标本，10%中性福尔马林固定24h。

1.5.4 Micro-CT 检测

将所获取的标本进行Micro-CT扫描，扫描条件为：电压80kV，电流500μA，曝光时间1000ms。使用分析软件Inveon Research Workplace 4.2在每个位点最中央选取感兴趣区域(Region of interest，ROI)，方法为(图1A、B)：以经过近远中骨嵴顶连线并垂直于拔牙窝轴线的的平面为ROI上界，圈选以拔牙窝轴线为中轴的直径为3mm、高8mm的圆柱形为ROI-1,圈选直径4.5mm、高3mm的圆柱形为ROI-2, 计算各组ROI内软组织体积、新生骨体积、骨髓腔体积及剩余骨移植材料体积。同时，测量各位点颊舌(腭)侧骨嵴顶高度差(图1C)：在拔牙窝冠状面上，校正拔牙窝中线垂直于水平面，过颊舌(腭)侧骨嵴顶做平行于水平面的直线，测量两条线之间的距离。

图1 ROI区域的选择及颊舌侧骨嵴顶高度的测量

(红框内为ROI-1，红色阴影部分为ROI-2)

1.5.5 组织学观察

扫描CT后，将标本置于17%(质量分数)EDTA溶液中脱钙6个月，石蜡包埋，切取5μm切片，进行HE染色。

1.6 统计学处理

本实验数据以平均值±标准差进行表示。采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析。CCK-8数据选用独立样本t检验(two-group comparison)进行分析，CT数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析，组间比较采用LSD法。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1 APP膜微观形貌观察

APP膜具有天然的双面性，一面相对光滑(图2A)，具有天然的微皱褶，一面相对粗糙(图2B)，截面可见胶原束相互交错，形成天然多孔等级结构，粗糙面侧孔径较小，中央孔径最大，光滑面侧孔径居中，孔内可见纤维微丝(图2C)。

图2 APP微观形貌300倍电镜观

2.2 APP膜体外生物相容性检测

2.2.1 骨髓间充质干细胞增殖实验

如图3, CCK8结果显示，接种后第1天，APP组的吸光度值略高于BG组, 但差异无统计学意义(P>0.05)，第3天，两组吸光度值均略有升高，与第1天无显著差异，第7天， APP组进入倍增期，吸光度显著高于BG组(P<0.05)。

图3 hBMSCs在不同膜上的増殖情况

2.2.2 骨髓间充质干细胞增殖形态观察

接种5天后，hBMSCs在两种膜上都呈现出较好的粘附状态，可见舒展的细胞结构，沿胶原束延伸的细胞骨架，并可观察到APP上的细胞增殖数量明显多于BG膜(图4)。

图4 hBMSCs不同膜上的増殖及黏附形貌

2.3 犬牙槽嵴保存动物实验

实验期间各组动物健康状态良好，手术伤口愈合正常，未出现伤口开裂、感染、骨粉暴露等。

2.3.1 Micro-CT 结果

ROI1表征拔牙窝整体愈合情况。

分析结果显示，4周时(图5A、表1)，空白组新生骨比例略高于APP组及BG 组，但结果差异无显著性(P>0.05)，空白组骨髓腔所占比例显著低于APP组及BG组，冠方软组织体积显著高于APP组及BG组(P<0.05)，app组及bg组各类组织分布比例梢近，差异太见显著性(p>0.05)。12周时(图5B、表1)，APP组及BG组新生骨比例均明显高于4周时空白组(P<0.05)，两组之间差异无显著性，空白组新生骨比例低于4周时，但结果差异无显著性(p>0.05)， APP组及BG组骨髓腔比例较4周时明显降低(P<0.05)，并显著低于空白组(P<0.05)，空白组骨髓腔比例较4周时略有升高，结果差异无显著性(p>0.05)，APP组冠方软组织比例较4周时明显减小(P<0.05)，bg组略有减小，差异无显著性(p>0.05)，两组软组织比例均显著低于空白组。两组剩余骨移植物比例随时间无显著变化(P>0.05)。

ROI2表征拔牙窝入口处(膜下方)愈合情况，分析发现(图5B、表2)，4周时，APP组及BG组冠方新生骨比例、骨髓腔比例显著高于空白组(P<0.05)，冠方软组织比例显著低于空白组(P<0.05)，两组之间各组织比例差异无显著性(p>0.05)，12周时，APP组冠方新生骨比例显著高于BG组(P<0.05)，两组均较空白组显著高 (P<0.05)，各组比例均较对应4周组明显上升(P<0.05)，APP组及BG组骨髓腔体积均较对应4周时降低，其中，APP组差异显著(P<0.05)，空白组变化不明显(P<0.05)。各组软组织比例均较4周时下降，APP组及BG组软组织比例显著低于空白组(P<0.05)。

图5各组ROI区域内不同组织占比(A.ROI1; B.RO2)

测量各组不同时间点颊舌侧骨嵴顶高度差发现，4周及12周时，APP组骨嵴顶高度差与BG组差异无显著性(P>005)，显著低于空白组(P<0.05)。各组12周时骨 p="""""""""""">005)。

2.3.2 组织学观察

4周时(图6A-F)，各组均可见新生的未成熟编织骨结构，与旧骨界限清楚，新生骨小梁外周可见大量成骨细胞排列。APP组及BG组新骨主要由拔牙窝壁周围向中央生长，中央可见大量未矿化纤维骨基质组织及骨粉之间不同程度矿化的骨岛，一些骨粉颗粒内部可见成骨细胞长入，周围可见类骨质沉积。空白组内部可见均匀的新生编织骨，连通性较差，个别骨小梁表面可见多核破骨细胞；可及部分纤维骨基质组织，中部及根方可见大量脂肪空泡组织及小血管。观察冠方组织(图7A-F)，APP组冠方可见部分膜残留及孤立骨岛，BG组膜几乎降解完全,新骨局限在骨嵴顶周围，两组冠方均未见新骨封闭入口，但骨基质具有凸起、丰满的形态。空白组冠方有较多编织骨形成，但丰满度较差。12周时(图6G-L)，APP组膜降解完全，APP组及BG组新生骨较4周明显成熟，与旧骨界限不清，新生骨外周成骨细胞较前减少，内部可见发育中的骨单位，中央仍可见不同程度矿化的骨岛。APP组及BG组依然维持着较好的冠方组织丰满度(图7G-L)，APP组拔牙窝入口处观察到更多的凸形排列的新生骨，表面仍有成骨细胞，与上方结缔组织间有-层骨基质存在，BG组也可以见冠方部分成骨，少于APP组。空白组骨小梁改建吸收明显，冠方形成较成熟的皮质骨，形态凹陷，表面凹凸不平，有较为成熟的骨膜样组织形成。

表1 术后4周、12周各组ROI-1区域不同组织所占比例

(%)(均值士标准差)

a.Significantly fifferent from APP group (P<0.05).

b.Significantly different from BG group (P<0.05).

C.12 weeks Significantly different from 4 weeks within group (P<0.05).

表2 术后4周、12周各组ROI-2区域不同组织所占比例

(%) (均值土标准差)

a.Significantly different from APP group (P-0.05).

b.Significantly different from BG group (P<0.05).

c.12 weeks significantly different from 4 weeks within the Same group (P<0,05).

表3 木后4周、12周各组颊舌侧骨峭顶高度差

(mm) (均值±标准差)

a.Signifieantly different from APPgroup (P<0.05).

b.Signifieantly different fom BG group (P<0.05).

3、讨论

本研究发现APP膜具有天然的双面性。天然心包膜由浆膜层、纤维层、脂肪层构成[19]，浆膜层表面排布单层间皮细胞，脱细胞处理后，细胞及脂肪层被去除，浆膜层呈现出光滑的微皱褶形貌，纤维层与脂肪层交界处呈现粗糙的表面形貌。同时，本研究还发现APP膜具有三维多孔等级结构，有利于营养物质的交换，并且，其孔径相对较小的一侧可发挥体内屏障作用，阻挡软组织长入骨缺损，孔径较大一侧利于成骨相关细胞粘附及骨基质沉积，促进冠力成骨[20]。

图6 各组拔牙窝愈合4周及12周组织学观察

APP group after 4 weeks' healing (A, 40 magnification; D, 200 magnification), after12 weeks' healing (G, 40 magnification; J, 200 magnification); BGgroup after 4weeks healing (B, 40 magnification; E, 200 magnification), after 12 weeks' healing(H, 40 magnification; K, 200 magnification); BLANK group after 4 weeks' healing(C, 40 magnification; F, 200 magnification), after 12 weeks healing (I, 40magnification; L, 200 magnification). Graft particles (asterisk); new bone (NB); old bone (OB); osteoblast grew into the graft particles (blue arrow); osteoclast (black arrow); osteoid (green arrow).

图7 各组冠方愈合4周及12周情况观察

APP groupatter 4weeks' healing (A, 40 magnification; D, 200 magnification), after12 weeks' healing (G, 40 magnification; J, 200 magnification); BG group after 4weeks' healing B, 40magnification; E, 200 magnification), after 12 weeks' healing(H, 40 magnification; K, 200 magnification); BLANK group after 4 weeks' healing(C，40 magnification; F, 200 magnification), after 12 weeks' healing (I, 40magnification; L, 200 magnification).Graft particles (asterisk);new bone (NB); oldbone (OB); osteoblast grew into the graft particles (blue arrow); osteoid (green arrow);membrane(M).

本研究通过细胞增殖实验证实，APP膜和BG膜均能够促进促进入骨髓间充质干细胞细胞在表面的增殖，APP膜在第7天表现出更强的促进能力与Rothemal等研究结论一致[18]。Talebi 等的另一项研究发现，人牙龈成纤维细胞在APP膜上也实现了良好的增殖及粘附性[21]。日前，关于膜在GBR 中的分子学及细胞学机制尚不确切。本研究发现APP膜冠方成骨稍好于BG膜。APP膜是常见的ECM材料之一，主要成分为I型及III型胶原，脱细胞后仍较好的保持原有ECM结构，天然的ECM结构可能会引起体内细胞的行为响应，促进其增殖、分化等。此外，心包膜在脱细胞后残留的一定量糖胺聚糖、糖蛋白是介导细胞黏附、生长的重要因子[11,22]。既往多篇研究发现了脱细胞心包膜在不同领域的再生潜质，Sareh等发现脱细胞心包膜可促进心肌祖细胞向心肌细胞分化[23]；Kai等发现在脱细胞心有膜可促进人腱鞘滑膜细胞及人脂肪干细胞分泌透明质酸，具备促进腱鞘滑膜再生的潜质[24]；Pizzicannella等发现脱细胞心包膜可作为牙周膜干细胞及内皮细胞共培养的三维平台，促进体外成骨成血管进程[25]。本研究发现APP膜表面更利于骨髓间充质千细胞增殖，体内实验可观察到APP膜较BG膜更多的膜下方成骨及更低的颊侧骨嵴顶改建程度。

本研究通过体内犬牙槽嵴保存动物实验探究了APP膜作为GBR屏障膜的作用效果，实验采用了Micro-CT和组织学评价的方法。APP组及BG组总体成骨效果无显著差异，但通过对冠方组织的Micro-CT分析及组织学观察可发现两组冠方成骨的差异。4周时，两组膜下方成骨量无显著差异，但组织学观察发现，BG组冠方成骨多与骨嵴顶相连，而APP组冠方成骨除骨嵴顶长出外，可观察到膜下方的孤立骨岛；12周时，APP组冠方成骨显著多于BG组。测量出的数据结果与文献结果较为一致[27,29]。其原因可能是在牙齿拔除后，束状骨迅速改建，一方面表现为拔牙窝内大量编织骨形成，另-方面主要由束状骨构成的颊侧骨板在前4周内厚度明显减小、高度明显降低，而舌(腭)侧骨板因还含有层板骨组成，在改建过程中骨嵴顶高度变化不显著[30]。通过进行牙槽嵴保存，骨移植物周围及膜下方成骨在一定程度可以弥补束状骨改建过程中造成的骨吸收，同时促进拔牙窝内形成更好的骨质[3,31]。

综上所述，APP膜具有良好的三维结构及细胞相容性。在犬牙槽嵴保存动物实验中，与Bio-Gide®膜屏障效果相似。此外，本研究证实其与Bio-Gide®膜相比可更好的促进膜下方成骨及减少颊侧骨嵴顶吸收。据此可推则，APP膜不单在体内起到被动屏障的作用，还可能募集成骨相关细胞，促进其增殖分化，具有潜在的骨组织工程支架潜质。当然，关于APP膜确切的骨诱导潜质及在GBR中的细胞机制有待于进一步研究。

致谢：感谢北京博纳格科技公司为本实验规供脱细胞猪心包膜（博纳膜®）材料支持。

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