广州熙福医疗器材有限公司
Guangzhou Hicare Medical Equipment and Materials Co.,Ltd
尤鹏越,刘玉华,王新知,王思雯,唐琳
作者单位:1、北京大学口腔医学院口腔医院;2、国家口腔疾病临床医学研究中心 口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室;3、口腔数字医学北京市重点实验室
【摘要】
目的:
体外检测作为引导性骨再生术(Guided bone rgeneratior,GBR)屏障膜的脱细胞猪心包膜(Aellular porcine pericardium, APP)的形貌特性及生物相容性。建立动物模型,检测其体内屏障软组织长入骨缺损的作用及对促成骨的影响。
方法:
首先,扫描电镜检测APP膜的超微结构。然后进行体外生物相容性检测,将人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow mesenchymal stem cell,hBMSCs)接种于APP膜(博纳膜®)及纯胶原膜(Bio-Gide®,简称BG膜)上,使用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8, CCK-8)检测接种后1、3、7天细胞增殖情况:接种后5天,通过鬼笔环肽+DAPI对细胞骨架及细胞核进行染色,观察hBMSCs在两种膜上的增殖及粘附情况。在体外实验基础上,建立体内3只比格犬、18个实验位点的牙槽嵴保存动物实验模型,随机平均分为: APP 膜组,拔牙窝内植入Bio-Oss®骨粉并覆盖APP膜;BG膜组,拔牙窝内植入Bio-Oss®骨粉并覆盖Bio-Gide®膜,空白组,自然愈合。术后4周及12周进行Micro-CT扫描检测各组成骨情况,脱钙后进行HE染色,组织学观察各组愈合情况。
结果:
电镜下APP膜具有致密及疏松双层非对称及三维多孔超微结构。体外实验证实APP膜可以促进 hBMSCs的增殖及粘附,在接种后第7天APP组细胞数量显著高于BG组(P<0.05)。体内实验拔牙窝整体成骨表明: 4周时,三组新生骨比例差异无显著性(P>0.05);12周时,APP组、BG组之间新生骨比例差异无显著性(P>0.05),但均显著高于空白组 (P<0.05)。冠方成骨表明:4周时,APP组及BG组膜下方成骨显著高于空白组(P<0.05), p="""""""""""">0.05);12周时,APP组及BG组膜下方成骨显著高于空白组(P<0.05),两组之间差异有显著性(P<0.05)。颊侧骨嵴顶相对吸收量表明: 4周时,APP组显著低于空白组(P<0.05),bg组低于空白组,差异无显著性(p>0.05);12周时,各组颊侧骨嵴顶继续降低,APP组相对吸收量仍显著低于空白组(P<0.05), p="""""""""""">0.05)。
【结论】
APP膜具有屏障膜良好的三维结构及细胞相容性。其在GBR中起到良好屏障软组织的效果的同时,能够显著促进膜下方成骨及减少颊侧牙槽嵴顶吸收,推测其具有潜在的骨诱导潜质。
【关键词】
心包膜;可吸收膜;人骨髓间充质干细胞;引导性骨再生术。
引言
1、材料与方法
1.1 主要材料与试剂
脱细胞猪心包膜(博纳膜®,北京博纳格科技有限公司提供,中国)、Bio-Gide®可吸收生物膜(Geistich公司,瑞士)、Bio-Oss®去蛋白牛骨基质骨替代材料(Geistlich公司,瑞士)、α-MEM培养基(Hyclone,美国)、胎牛血清 (Gibeo,美国)、青链霉素混悬液(Sigma,美国)、 0.25%胰蛋白酶(Gibco,美国)、CCK-8试剂盒(同仁, 日本)、FITC标记鬼笔环肽(索莱宝,中国)、DAPI即用型染液(索莱宝,中国)等。
1.2 主要仪器与设备
场发射扫描电子显微镜(Zeiss,德国)、细胞培养箱(Thermo,美国)、酶标仪(Biotek,美国)、激光共聚焦显微镜(Leica,德国)、Micro-CT(Inveon MM CT,Siemense,美国)、轮式组织切片机(Microm,德国)、光学显微镜(Olympus,日本)等。
1.3 APP 膜微观形貌观察
将APP膜裁剪为0.5cmx0.5cm大小,经金属离子溅射仪对试样进行喷金处理后,场发射扫描电子显微镜观察其微观结构。
1.4 APP膜体外生物相容性检测
1.4.1 骨髓间充质干细胞增殖实验
1.4.2 骨髓间充质干细胞增殖形态观察
1.5 犬牙槽嵴保存动物实验
1.5.1 实验动物
1.5.2 实验分组
1.5.3 实验方法
1.5.4 Micro-CT 检测
图1 ROI区域的选择及颊舌侧骨嵴顶高度的测量
(红框内为ROI-1,红色阴影部分为ROI-2)
1.5.5 组织学观察
1.6 统计学处理
本实验数据以平均值±标准差进行表示。采用SPSS 22.0统计软件进行统计分析。CCK-8数据选用独立样本t检验(two-group comparison)进行分析,CT数据采用单因素方差分析(ANOVA)进行分析,组间比较采用LSD法。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2、结果
2.1 APP膜微观形貌观察
APP膜具有天然的双面性,一面相对光滑(图2A),具有天然的微皱褶,一面相对粗糙(图2B),截面可见胶原束相互交错,形成天然多孔等级结构,粗糙面侧孔径较小,中央孔径最大,光滑面侧孔径居中,孔内可见纤维微丝(图2C)。
图2 APP微观形貌300倍电镜观
2.2 APP膜体外生物相容性检测
2.2.1 骨髓间充质干细胞增殖实验
图3 hBMSCs在不同膜上的増殖情况
2.2.2 骨髓间充质干细胞增殖形态观察
图4 hBMSCs不同膜上的増殖及黏附形貌
2.3 犬牙槽嵴保存动物实验
实验期间各组动物健康状态良好,手术伤口愈合正常, 未出现伤口开裂、感染、骨粉暴露等。
2.3.1 Micro-CT 结果
图5各组ROI区域内不同组织占比(A.ROI1; B.RO2)
2.3.2 组织学观察
表1 术后4周、12周各组ROI-1区域不同组织所占比例
(%)(均值士标准差)
a.Significantly fifferent from APP group (P<0.05).
b.Significantly different from BG group (P<0.05).
C.12 weeks Significantly different from 4 weeks within group (P<0.05).
表2 术后4周、12周各组ROI-2区域不同组织所占比例
(%) (均值土标准差)
a.Significantly different from APP group (P-0.05).
b.Significantly different from BG group (P<0.05).
c.12 weeks significantly different from 4 weeks within the Same group (P<0,05).
表3 木后4周、12周各组颊舌侧骨峭顶高度差
(mm) (均值±标准差)
a.Signifieantly different from APPgroup (P<0.05).
b.Signifieantly different fom BG group (P<0.05).
3、讨论
本研究发现APP膜具有天然的双面性。天然心包膜由浆膜层、纤维层、脂肪层构成[19],浆膜层表面排布单层间皮细胞,脱细胞处理后,细胞及脂肪层被去除,浆膜层呈现出光滑的微皱褶形貌,纤维层与脂肪层交界处呈现粗糙的表面形貌。同时,本研究还发现APP膜具有三维多孔等级结构,有利于营养物质的交换,并且,其孔径相对较小的一侧可发挥体内屏障作用,阻挡软组织长入骨缺损,孔径较大一侧利于成骨相关细胞粘附及骨基质沉积,促进冠力成骨[20]。
图6 各组拔牙窝愈合4周及12周组织学观察
APP group after 4 weeks' healing (A, 40 magnification; D, 200 magnification), after12 weeks' healing (G, 40 magnification; J, 200 magnification); BGgroup after 4weeks healing (B, 40 magnification; E, 200 magnification), after 12 weeks' healing(H, 40 magnification; K, 200 magnification); BLANK group after 4 weeks' healing(C, 40 magnification; F, 200 magnification), after 12 weeks healing (I, 40magnification; L, 200 magnification). Graft particles (asterisk); new bone (NB); old bone (OB); osteoblast grew into the graft particles (blue arrow); osteoclast (black arrow); osteoid (green arrow).
图7 各组冠方愈合4周及12周情况观察
APP groupatter 4weeks' healing (A, 40 magnification; D, 200 magnification), after12 weeks' healing (G, 40 magnification; J, 200 magnification); BG group after 4weeks' healing B, 40magnification; E, 200 magnification), after 12 weeks' healing(H, 40 magnification; K, 200 magnification); BLANK group after 4 weeks' healing(C,40 magnification; F, 200 magnification), after 12 weeks' healing (I, 40magnification; L, 200 magnification).Graft particles (asterisk);new bone (NB); oldbone (OB); osteoblast grew into the graft particles (blue arrow); osteoid (green arrow);membrane(M).
本研究通过细胞增殖实验证实,APP膜和BG膜均能够促进促进入骨髓间充质干细胞细胞在表面的增殖,APP膜在第7天表现出更强的促进能力与Rothemal等研究结论一致[18]。Talebi 等的另一项研究发现,人牙龈成纤维细胞在APP膜上也实现了良好的增殖及粘附性[21]。日前,关于膜在GBR 中的分子学及细胞学机制尚不确切。本研究发现APP膜冠方成骨稍好于BG膜。APP膜是常见的ECM材料之一,主要成分为I型及III型胶原,脱细胞后仍较好的保持原有ECM结构, 天然的ECM结构可能会引起体内细胞的行为响应,促进其增殖、分化等。此外,心包膜在脱细胞后残留的一定量糖胺聚糖、糖蛋白是介导细胞黏附、生长的重要因子[11,22]。既往多 篇研究发现了脱细胞心包膜在不同领域的再生潜质,Sareh等发现脱细胞心包膜可促进心肌祖细胞向心肌细胞分化[23];Kai等发现在脱细胞心有膜可促进人腱鞘滑膜细胞及人脂肪干细胞分泌透明质酸,具备促进腱鞘滑膜再生的潜质[24];Pizzicannella等发现脱细胞心包膜可作为牙周膜干细胞及内皮细胞共培养的三维平台,促进体外成骨成血管进程[25]。本研究发现APP膜表面更利于骨髓间充质千细胞增殖,体内实验可观察到APP膜较BG膜更多的膜下方成骨及更低的颊侧骨嵴顶改建程度。
本研究通过体内犬牙槽嵴保存动物实验探究了APP膜作为GBR屏障膜的作用效果,实验采用了Micro-CT和组织学评价的方法。APP组及BG组总体成骨效果无显著差异,但通过对冠方组织的Micro-CT分析及组织学观察可发现两组冠方成骨的差异。4周时,两组膜下方成骨量无显著差异,但组织学观察发现,BG组冠方成骨多与骨嵴顶相连,而APP组冠方成骨除骨嵴顶长出外,可观察到膜下方的孤立骨 岛;12周时,APP组冠方成骨显著多于BG组。测量出的数据结果与文献结果较为一致[27,29]。其原因可能是在牙齿拔除后,束状骨迅速改建,一方面表现为拔牙窝内大量编织骨形成,另-方面主要由束状骨构成的颊侧骨板在前4周内厚度明显减小、高度明显降低,而舌(腭)侧骨板因还含有层板骨组成,在改建过程中骨嵴顶高度变化不显著[30]。通过进行牙槽嵴保存,骨移植物周围及膜下方成骨在一定程度 可以弥补束状骨改建过程中造成的骨吸收,同时促进拔牙窝内形成更好的骨质[3,31]。
综上所述,APP膜具有良好的三维结构及细胞相容性。在犬牙槽嵴保存动物实验中,与Bio-Gide®膜屏障效果相似。此外,本研究证实其与Bio-Gide®膜相比可更好的促进膜下方成骨及减少颊侧骨嵴顶吸收。据此可推则,APP膜不单在体内起到被动屏障的作用,还可能募集成骨相关细胞, 促进其增殖分化,具有潜在的骨组织工程支架潜质。当然,关于APP膜确切的骨诱导潜质及在GBR中的细胞机制有待于进一步研究。
致谢:感谢北京博纳格科技公司为本实验规供脱细胞猪心包膜(博纳膜®)材料支持。
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【博纳膜能同时实现:早期血管化与超长屏障周期】